His标签纯化介质产品说明书
Ni Bestarose 6Fast Flow
Ni Bestarose High Performance
1、简介
琼脂糖亲和介质（Ni）是将金属离子Ni2+螯合在琼脂糖凝胶上形成的一种亲和层析介质，具有吸附容量大、选择型好、易于再生、成本低等优点，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质及多肽的分离纯化，尤其是组氨酸标记蛋白质的高效纯化。
2、介质性质
● 琼脂糖浓度
6%
● 介质平均颗粒
34μm ( Ni Bestarose High
Performance) 和90μm（Ni
Bestarose 6 Fast Flow）
● 功能基团
Ni2+
● 结合载量
约40mg His标签蛋白/ml介质
● 建议pH范围
3-12（工作），2-14（短期）
● 推荐流速
150cm/h（最大）
● 化学稳定性
40
℃放置一周：0.01M HCl，0.1M NaOH；
12h：1M NaOH，70%乙酸；
● 存放条件
4-30℃
● 运输与储存溶液
20%乙醇
3、建议实验条件
3.1 结合、清洗缓冲液的选择
适用于His标签纯化过程的缓冲液首选磷酸盐缓冲液，pH范围在中性（7-8之间），避免适用EDTA及柠檬酸盐。
结合缓冲液需要含有低浓度的咪唑，这可以减少宿主蛋白同介质的非特异结合，同时样品中也要加入相同浓度的咪唑。
清洗缓冲液中含尽可能高的咪唑浓度可以增加重组histidine-tagged蛋白的纯度，但是该浓度条件下，不能把histidine-tagged蛋白洗脱下来。
3.2 样品的准备
在层析过程中，需要准备符合层析要求的样品溶液。
样品缓冲液应尽可能与结合缓冲液 一致。固体样品可用结合缓冲液溶解配制；低浓度样品溶液可用结合缓冲 透析；高浓度样品溶液可用结合缓冲液稀释。重组histidine-tagged蛋白以包涵体的形式表达，可以在缓冲液中加入6M盐酸胍或8M尿素。当使用盐酸胍或尿素时，蛋白会解折叠，在柱上或洗脱后蛋白解折叠，这取决于不同的蛋白。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm或者是0.22μm）处理。
3.3 洗脱
3.3.1 可通过提高咪唑的浓度进行洗脱。
3.3.2 可降低缓冲液的pH进行洗过，当缓冲液pH降低至4以下时，金属离子会同介质解离从而达到洗脱目的。（如果目的蛋白对低pH敏感，建议洗脱液中加入1/10体积的1M Tris-HCl，pH9.0进行中和）
3.3.2 螯合剂EGTA和EDTA可将金属离子同介质解离而达到洗脱目的，洗脱产物中的Ni2+可用脱盐柱去除。介质可用0.1M NiSO4再次饱和后使用。
4、应用举例
例一：
图一
Ni-FF分离纯化His标签蛋白
层析柱：EzFast
1 ml
样品：大肠杆菌BL21裂解液上清
结合缓冲液：20mM PB 0.5 M NaCl 20mM咪唑, pH 7.6
洗脱缓冲液：20mM PB 0.5 M NaCl 500mM咪唑, pH 7.6
5、稳定性
His标签介质在所有常用缓冲液中保持稳定。若要长期保存，需要浸泡在20%乙醇中并储藏于4-8℃条件下。
6、再生和在位清洗（CIP）
6.1 再生
6.1.1用2-5倍介质体积脱镍缓冲液（50mM PB，300mM
NaCl，100mM EDTA,pH 8.0）过柱子；
6.1.2用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流速，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min以上；
6.1.3用10倍介质体积去离子水洗柱；
6.1.4用3倍介质体积0.5M NaAC pH4.0缓冲液平衡柱子；
6.1.5用3倍介质体积0.1M NiSO4过柱；
6.1.6用3倍介质体积0.5M NaAC pH4.0缓冲液洗柱；
6.1.7用5倍介质体积平衡缓冲液平衡柱子。
6.2 在位清洗
6.2.1除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床体积的2M NaCl溶液清洗柱子，再用平衡缓冲液清洗柱子；
6.2.2除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以100cm/h的流速清洗柱子1h；
6.2.3除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%乙醇或者30%异丙醇洗柱子，再用平衡缓冲液平衡柱子。
7、储存
His标签纯化介质保存在含有20%乙醇溶液中，4-8℃下长期保存。
