菌种鉴定报告
1 材料与方法
1.1 材料
Taq酶 EP0402 Fermentas
DNA片段胶回收试剂盒AP-GX-50 Axygen
pGEM-T
货号A3600 Promega
LB培养基
购于上海生工
氨卡青霉素钠 购于上海生工
1.2 主要仪器
PCR仪器 ABI 9700型PCR仪
电泳仪 BioRad
高速离心机 Thermo
高压灭菌锅 SANYO全自动高压灭菌锅
移液器 Thermo
1.3 方法
1.3.1 菌落PCR
使用27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1497R:GGTTACCTTGTTACGACTT 进行扩增,引物为南京金斯瑞生物科技有限公司合成,储存浓度为100μm,使用浓度为10μm。按照如下方法混合各种PCR反应溶液:Buffer(Kcl) 2.5μl, 2mMdNTPs 2.5μl,27F 2μl , 1497R 2μl, 25Mm MgCl2
1.5μl, Taq 0.5μl, ddH2O 14μl. 混合后用10μl的吸头撰取菌液在混和液中搅动一下,然后进行PCR。
PCR反应参数如下:94℃ 4min; 94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 2min,30循环; 72℃ 10min。PCR结束后,1%琼脂糖鉴定,并使用Axygen AP-GX-50 DNA片段胶回收试剂盒回收PCR片段。
1.3.2 T载体连接
用T载体连接PCR回收片段,按照如下混合:
2×Rapid Buffer 5μl, T载体 1μl, 片段 3μl, T4 DNA Ligase 1μl. 混合后室温1小时。
1.3.3 转化
取100μl的JM109感受态细胞,冰上解冻,取10μl的连接产物混入,冰上静置30min,然后42℃热击90s,迅速放入冰山静置5min,加入LB培养基,37℃
150rpm 培养1小时,然后涂布于LA(含50μg/mL的氨卡青霉素钠),37度培养过夜,第二天菌落PCR鉴定阳性克隆。
1.3.4 阳性克隆鉴定
分别挑取一定数量的克隆,采用菌落PCR方法进行PCR鉴定(方法见1.3.1),同时用LA培养基培养每个克隆。鉴定结果用1%的琼脂糖鉴定,取能PCR出阳性片段的克隆送测序
1.3.5 测序比对
使用网络服务器http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的Blastn进行比对。
2 结果